多轮多色 mIHC 成像：单轮与多轮怎么选
从既有扁桃体视频示例理解多轮 mIHC 染色、重复成像与 DAPI 配准，区分单轮8标加DAPI和多轮14/16标项目经验，按目标、组织条件及分析交付选择路径。
多轮多色 mIHC 将染色、重复成像和跨轮配准连起来，在同一张切片上组合更多蛋白标记。是否需要多轮，应先看研究问题、Panel 与组织条件，而不是只追求标记数量。
从单轮到多轮：保留组织坐标，组合多个标记
如何在同一张组织切片上组合多个蛋白标记，并保留它们的位置关系？本期视频用于理解 mIHC（多重免疫组化） 的循环染色与成像流程，并介绍 BIOMO 如何衔接染色、成像和图像分析。
循环染色：处理前一轮信号并检查组织状态
传统的检测往往受限于颜色通道，而我们的 多轮多色染色技术 打破了这一瓶颈：
重复进行： 在同一张切片上循环进行“染色-成像-信号去除”。
组织与抗原检查： 每轮成像后，按方案进行抗体洗脱或信号处理，再进入后续染色。需要检查组织完整性、残留信号、抗原保留与标记顺序，不能把多轮操作视为完全无损。
DAPI参考与跨轮配准
多轮图像如何对应到同一坐标？可重复采集的参考之一是 DAPI： 每一轮检测都会重复获取 DAPI 图像，将其作为共同参考基准。配准算法利用共同结构对齐不同轮次，再整合各轮 Marker 信息。应检查组织形变、局部偏移和配准质量，不能假定所有区域都能一一完美对应。
视频示例：扁桃体组织中的标记与空间关系
视频以扁桃体组织展示“三轮三标四色”的设计思路，帮助理解抗体轮次、通道染料与组织观察之间的关系。该视频示例与下文已完成的14/16标项目经验分别描述，不直接视为同一实验或同一组数据：
B细胞区： 通过 CD20 和 CD21 揭示 B 细胞富集区及滤泡结构。
T细胞群： CD4 与 CD8 勾勒出不同 T 细胞亚群在组织中的分布。
髓系与边界： CD68、CD11c 与 PanCK 组合，同步呈现髓系细胞与上皮边界的空间关系。
结构与免疫： 进一步结合 aSMA 和 Tryptase，观察结构支撑成分与局部免疫成分的交织。
EVOS S1000：区分平台单轮能力与多轮实验
EVOS S1000 的单轮采集能力与多轮实验是两个层次：
单轮最多 8 个蛋白靶标 + DAPI（8 标 9 色）。
更多标记可评估多轮 TSA 染色、抗体洗脱、重复成像与配准；可用轮次受组织状态、抗体组合和质控限制。
最终实现更高维度、更全视野的多色多标检测结果。
单轮与多轮，怎样按研究目的选择？
佰默已完成扁桃体16标和胃癌14标 TSA 多轮实验，标记数量通过染色、洗脱、重复成像与跨轮配准实现。这属于具体项目经验，不代表仪器单轮同时采集14/16个靶标，也不保证新组织或新 Panel 能直接沿用同样条件。
| 你的研究需求 | 优先讨论 | 需要特别核对 |
|---|---|---|
| 一轮标记已能回答主要问题 | 单轮路径；平台最多8个蛋白靶标加DAPI。 | 抗体与染料组合、组织自发荧光、未染/单染对照和光谱拆分。 |
| 需要更多共表达或微环境信息 | 多轮路径；先规划目标、轮次和标记顺序。 | 抗体洗脱、信号残留、组织保存、跨轮配准与失败处理。 |
| 需要细胞定量、邻近关系或TLS研究 | 将图像采集与下游分析一起规划，不只增加标记。 | 区域定义、细胞分割、表型规则、空间指标、数据格式与复核方式。 |
项目评估前，请说明组织与固定保存方式、切片条件、目标标记、样本数量，以及需要图像还是进一步的细胞/空间数据。基础图像、细胞定量与空间分析分别约定；分析结果仍需结合图像与质控复核。
有样本需要委托：查看 mIHC 多色免疫荧光检测与空间分析服务。先选标记组合：查看 TLS、肿瘤免疫与耗竭 Panel。已有实验平台：查看九色试剂盒，具体试剂、设备和组织的兼容性仍需单独验证。
从流程视频，到自有扁桃体观察图
想先看同一组织视野里不同标记怎样分布，可查看佰默自有扁桃体展示图组：包括合成观察、DAPI 核染，以及 CD20、CD8、Ki67、PanCK 的代表靶标与 DAPI 叠加视图。图组用于理解组织中的多标记分布，不用于比较强度、阳性率或空间统计结果，也不单独证明配准精度。
本文视频侧重解释循环染色与成像流程，服务页图组展示代表标记分布，两者分别呈现。“16标”属于多轮项目经历，不等于单轮16色；蛋白靶标、DAPI、染料颜色和轮次需要分别计数，不能根据这些展示视图推定完整的标记—轮次安排。
方法参考：配准与图像分析
多轮图像需要先检查组织对应关系，再进行细胞与空间分析。VALIS 原始方法论文（Nature Communications，2023）介绍全切片图像配准；QuPath 原始方法论文（Scientific Reports，2017）介绍数字病理图像分析。两篇论文用于理解方法背景，不是佰默项目验证或作者背书。具体项目仍需复核组织形变、局部配准、细胞分割与表型识别质量。
总结： 多轮 mIHC 可把更多蛋白标记放回组织坐标中解释；细胞表型和空间关系仍需结合对照、分割、配准质控与结果复核。
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